Zambrotta begon zijn profloopbaan in het seizoen 1994/1995 bij Como Calcio in de Serie B als rechtermiddenvelder. Na de degradatie van de club uit zijn geboorteplaats naar de Serie C1 vertrok Zambrotta in 1997 naar AS Bari. Bij deze club debuteerde hij in de Serie A. Na twee goede seizoenen maakte Zambrotta voor 15,8 miljoen euro de overstap naar Juventus. Daar werd hij door coach Marcello Lippi omgevormd tot vleugelverdediger, een plaats die hij naar eigen verbazing uitstekend invulde. Met Juventus won Zambrotta vier keer de Italiaanse landstitel (2002, 2003, 2005, 2006) en uiteindelijk kwam hij tot 217 competitieduels en zeven Serie A-doelpunten voor La Vecchia Signora. Een Europese prijs met Juventus bleef uit, hoewel de club in 2003 de Champions League-finale na strafschoppen verloor van AC Milan. In 2006 was Juventus ��n van de Italiaanse clubs die teruggezet werd naar de Serie B vanwege het voetbalschandaal waarbij bestuursleden van clubs scheidsrechters habben be�nvloed. Zambrotta wilde op het hoogste niveau blijven voetballen en vertrok voor 14 miljoen euro naar FC Barcelona, samen met de Fransman Lilian Thuram. De Italiaan tekende een contract voor vier jaar.